模基生物結(jié)直腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)基套裝

產(chǎn)品描述

?；锝Y(jié)直腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)基套裝是一種化學(xué)定義的細(xì)胞培養(yǎng)基，用于建立和維護(hù)人結(jié)直腸癌類(lèi)器官?；颊邅?lái)源的癌癥類(lèi)器官概括了原始腫瘤的基因組和病理特征，因此在醫(yī)學(xué)研究和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方面具有巨大的前景。

產(chǎn)品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質(zhì)膠

腫瘤組織消化液

紅細(xì)胞裂解液

類(lèi)器官消化液

類(lèi)器官冷凍保存培養(yǎng)基(無(wú)血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

FBS（胎牛血清）

EDTA

結(jié)直腸癌類(lèi)器官完全培養(yǎng)基的制備

使用無(wú)菌操作技術(shù)配制結(jié)直腸癌類(lèi)器官完全培養(yǎng)基。以下是準(zhǔn)備 10mL 完全培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整用量。

1. 冰上解凍結(jié)直腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)因子B (50x)和結(jié)直腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)因子C(250x)。

注意： 解凍后，建議將結(jié)直腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)因子B (50x)和結(jié)直腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)因子C(250x)分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融。

2. 將 200uL結(jié)直腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)因子B (50x)，40uL 結(jié)直腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)因子C(250x) 加至9.76mL結(jié)直腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，充分混合，配制成 10mL結(jié)直腸癌類(lèi)器官完全培養(yǎng)基。

注意：配制后的結(jié)直腸癌類(lèi)器官完全培養(yǎng)基可在 2-8°C 儲(chǔ)存，建議在兩周內(nèi)使用。結(jié)直腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)因子B(50x)內(nèi)含有細(xì)菌及真菌抗生素(50x)。

患者來(lái)源的結(jié)直腸癌類(lèi)器官的原代培養(yǎng)

注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關(guān)的機(jī)構(gòu)和政府法規(guī)。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

從初級(jí)組織中建立類(lèi)器官

1.用離心管將原發(fā)性人結(jié)直腸癌組織碎片收集在冰冷的原發(fā)組織儲(chǔ)存溶液中。將組織樣品保持在4°C，直到分離開(kāi)始。

2.評(píng)估獲得的組織碎片是否完全由上皮組成。 如果存在脂肪或肌肉組織，請(qǐng)?jiān)诮馄曙@微鏡下使用手術(shù)剪刀或手術(shù)刀和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒(méi)有脂肪或肌肉組織，請(qǐng)立即繼續(xù)下一步。

3.用結(jié)直腸癌類(lèi)器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或DPBS沖洗組織兩次。

4.使用手術(shù)剪刀或手術(shù)刀將組織切碎成1-3mm3的小碎片，置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

5.在37°C下用10mL腫瘤組織消化溶液在15mL離心管中消化組織片段，消化時(shí)間可變，從30分鐘到1.5小時(shí)不等。仔細(xì)監(jiān)測(cè)消化過(guò)程，可適當(dāng)吹打取上清觀察消化程度。當(dāng)大多數(shù)組織片段能夠通過(guò)1mL移液器吸頭時(shí)，消化過(guò)程即完成。

6.將FBS加入組織消化混合物中，最終濃度為2%，并使用100μm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾。

7.收集并在4°C下以250g離心過(guò)濾的細(xì)胞3分鐘。  在可見(jiàn)的紅色沉淀的情況下，吸入上清液，并使用2mL紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，在室溫下裂解紅細(xì)胞1分鐘，并在4°C下以250g離心3分鐘。

8.吸出上清液并將沉淀重懸于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在4°C下以250g離心3分鐘，再次重復(fù)此步驟。

9.吸出上清液并將沉淀重懸于基質(zhì)膠中。基質(zhì)膠應(yīng)保存在冰上以防止其凝固。盡快進(jìn)行該過(guò)程。使用的基質(zhì)膠的量取決于顆粒的大小。大約10，000個(gè)細(xì)胞應(yīng)接種在25 μ L基質(zhì)膠中。

10.關(guān)鍵：不要過(guò)度稀釋基質(zhì)膠（基質(zhì)膠應(yīng)>70%（基質(zhì)膠體積/總體積）），因?yàn)檫@可能會(huì)抑制固體液滴的正確形成。

將含有類(lèi)器官的基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板的底部，每個(gè)液滴圍繞孔中心約30 μ L。

關(guān)鍵：一旦類(lèi)器官重懸于基質(zhì)膠中，盡快進(jìn)行種板，因?yàn)榛|(zhì)膠可能會(huì)在試管或移液器吸頭中凝固。不要讓基質(zhì)顆粒接觸管壁。

11.將培養(yǎng)板放入37°C和5%CO ₂的培養(yǎng)箱中15-25分鐘，讓基質(zhì)凝膠固化。

12.準(zhǔn)備所需量的結(jié)直腸癌類(lèi)器官完全培養(yǎng)基。

13.一旦基質(zhì)膠滴凝固（15-25分鐘），打開(kāi)板并小心地向每個(gè)孔中加入500 μ L結(jié)直腸癌類(lèi)器官完全培養(yǎng)基。

關(guān)鍵：不要將培養(yǎng)基直接添加到基質(zhì)膠液滴的頂部，因?yàn)檫@可能會(huì)破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

14.將培養(yǎng)板置于37°C和5%CO ₂的恒溫培養(yǎng)箱中。

15.每隔3-4天更換一次培養(yǎng)基，小心地從孔中吸出培養(yǎng)基，并用新鮮的預(yù)熱的類(lèi)器官完全培養(yǎng)基代替它。

16.密切監(jiān)測(cè)類(lèi)器官生長(zhǎng)狀態(tài)，理想情況下，結(jié)直腸癌類(lèi)器官應(yīng)在 7 至 10 天內(nèi)建成。

結(jié)直腸癌類(lèi)器官的傳代培養(yǎng)

1、以下操作吹打細(xì)胞的吸頭均需用潤(rùn)洗液潤(rùn)洗后使用：

類(lèi)器官收集：待結(jié)直腸癌類(lèi)器官培養(yǎng)到直徑為200~500μm大小時(shí)（或變黑不再增大時(shí)），即可進(jìn)行結(jié)直腸癌類(lèi)器官的傳代（每代約5天左右）。吸棄舊培養(yǎng)基，加入等體積基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用細(xì)胞刮刀或者移液管吸頭尖端輕輕刮下（或吹打）細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)直腸癌類(lèi)器官混合物，轉(zhuǎn)移至1.5ml或15ml離心管中，吹打5~10次，使結(jié)直腸癌類(lèi)器官和細(xì)胞外基質(zhì)分離，300g離心3分鐘。

2、類(lèi)器官消化及清洗：棄上清，加入1mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打類(lèi)器官5~10次，取少量懸液鏡檢觀察類(lèi)器官狀態(tài)：

若類(lèi)器官已分散成碎片則可選擇機(jī)械吹打分散類(lèi)器官后直接300g離心3分鐘，離心后用PBS或基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2次。

若類(lèi)器官比較完整可300g離心3分鐘，棄上清，加入5倍于細(xì)胞外基質(zhì)和結(jié)直腸癌類(lèi)器官混合物體積的類(lèi)器官消化液，吹打混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中消化2分鐘。加入5倍于消化液體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化。離心后用PBS或基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗2次。

3、基質(zhì)膠3D包裹：清洗完成后將離心沉淀中的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞外基質(zhì)（>70%）并在冰上混勻（注意，混勻吹打的動(dòng)作要輕柔，切忌產(chǎn)生大量氣泡，常溫混勻則需要控制在15秒內(nèi)），混勻后置于冰上。

4、種板培養(yǎng)：用移液器吸去細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞的混合液移至培養(yǎng)板孔中，（如24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔點(diǎn)20~30μL混合懸液），混合懸液須點(diǎn)在培養(yǎng)孔底部中央位置，其鋪開(kāi)后不可接觸培養(yǎng)孔側(cè)壁。將培養(yǎng)本放入37℃，在5%二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育15分鐘，待細(xì)胞外基質(zhì)凝固至不再流動(dòng)后，沿孔壁緩緩加入完全培養(yǎng)基（以24孔為例，加500μL完全培養(yǎng)基），每3~4天更換一次完全培養(yǎng)基。

5、持續(xù)培養(yǎng)：將細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每1天于倒置顯微鏡下觀察結(jié)直腸癌類(lèi)器官的生長(zhǎng)狀態(tài)，每3天于倒置顯微鏡下拍照，記錄多個(gè)視野中的結(jié)直腸癌類(lèi)器官的形態(tài)和分布。