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產(chǎn)品描述

廈門?；?/span>人胃上皮類器官培養(yǎng)基套裝是一種化學定義的細胞培養(yǎng)基，用于建立和培養(yǎng)來自成體干細胞的人胃上皮類器官。胃上皮細胞的自我更新是由干細胞及其祖細胞的增殖所驅(qū)動的。人的胃上皮類器官具有所有的特征，包括在結(jié)構(gòu)、細胞類型組成和自我更新動力學方面，因此能用于對人類胃上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病的研究。

產(chǎn)品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質(zhì)膠

上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基  

類器官消化液  

潤洗液

類器官冷凍保存培養(yǎng)基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

胎牛血清(FBS)  

EDTA 

人胃上皮類器官原代培養(yǎng)培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基的制備

采用無菌技術(shù)制備人胃上皮類器官原代培養(yǎng)培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基的制備。在人胃上皮類器官穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基中生長的胃上皮類器官絕大多數(shù)由LGR5+干細胞，抗粘膜細胞、腺粘膜細胞、主細胞，以及少量腸內(nèi)分泌細胞組成。

以下是準備 10mL原代培養(yǎng)培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應調(diào)整用量。

1.冰上解凍人胃上皮類器官培養(yǎng)因子B、人胃上皮類器官培養(yǎng)因子C、人胃上皮類器官培養(yǎng)因子D。

注意： 解凍后，建議將人胃上皮類器官培養(yǎng)因子B、人胃上皮類器官培養(yǎng)因子C、人胃上皮類器官培養(yǎng)因子D分別分裝后保存取用，避免反復凍融。

2. 配制人胃上皮類器官原代培養(yǎng)培養(yǎng)基，專門用于原代培養(yǎng)和復蘇。添加200 μL人胃上皮類器官培養(yǎng)因子B (50x)、40 μL人胃上皮類器官培養(yǎng)因子C (250x)、40 μL人胃上皮類器官培養(yǎng)因子D (250x)、至9.72 mL人胃上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混合均勻。

3.配制人胃上皮類器官穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基，專門用于培養(yǎng)傳代。添加200 μL人胃上皮類器官培養(yǎng)因子B (50x)、40 μL人胃上皮類器官培養(yǎng)因子C (250x)至9.76 mL人胃上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混合均勻。

注意：配制后的人胃上皮類器官原代培養(yǎng)培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基可在 2-8°C 儲存，建議在兩周內(nèi)使用。人胃上皮類器官培養(yǎng)因子B(50x)內(nèi)含有細菌及真菌抗生素(50x)。

人胃上皮類器官的原代建立

注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關(guān)的機構(gòu)和政府法規(guī)。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

從初級組織中建立類器官

1. 使用離心管收集1-2 cm²原代人胃上皮組織收集在冰冷的原代組織儲存液中，將組織樣本保存在4°C，直到開始分離。

2. 評估獲得的組織碎片是否完全由上皮組織組成。如果存在脂肪或肌肉組織，請在解剖顯微鏡下使用手術(shù)剪刀或手術(shù)刀和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，請立即繼續(xù)下一步。

3.用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或DPBS沖洗結(jié)人胃上皮組織，直到上清澄清。

4. 在腺窩結(jié)構(gòu)分離之前，將基質(zhì)膠解凍并保持低溫。加入5 mL FBS至45 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備10%FBS培養(yǎng)基。

5. 將組織在細胞培養(yǎng)皿中使用外科剪刀或手術(shù)刀切成5mm³的小碎片。

注：分離的樣品必須足夠小，能夠通過10ml移液管的尖端。

6.將分離的樣品放入一個15毫升的離心管中，管中含有10ml預冷的DPBS。

7.用10ml移液管清洗樣品至少10次。

注：在接下來的步驟中，使用10%FBS培養(yǎng)基潤洗10ml移液管的內(nèi)表面以避免樣品粘在移液管壁上。

8.讓管子靜止不動，直到樣品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清液，加入10mL預冷DPBS。

9. 重復步驟7和8 3-5次，直到上清完全清澈。

注：徹底清洗樣品是避免細菌污染的關(guān)鍵。

10. 向試管中加入10ml預冷DPBS，并加入2.5 mM EDTA 。把管子放在搖床上，在4°C的溫度下輕輕搖動40分鐘。

11. 用EDTA處理后，保持試管靜止，直到樣品沉淀到試管底部，然后用10ml移液管取上清液，加入10ml預冷DPBS。

12. 讓管子靜止不動，直到樣品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清。

13. 加入10ml預冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。隱窩結(jié)構(gòu)會通過移液吸頭釋放到上清液中。將含有分離的隱窩的上清液放入新的15ml管中。

14. 加入10ml預冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。允許組織碎片在正常重力下下沉至少30秒鐘。隱窩被通過移液釋放到上清液中。將含有分離的隱窩的上清液放入一個新的15ml管中。

15. 在4℃、400g條件下離心3分鐘。吸出并丟棄上清。

16. 將沉淀重懸在1ml DPBS中，并將隱窩懸浮液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL管中。滴20 μL隱窩重懸液到培養(yǎng)皿中。在立體顯微鏡下計數(shù)隱窩的數(shù)量并計算隱窩的總數(shù)。

17. 在4℃、400g條件下離心3分鐘。吸出并丟棄上清。

18. 吸取上清，將沉淀重懸于基質(zhì)膠中?；|(zhì)膠應保存在冰上以防止固化。推薦重懸密度為每 25 μL基質(zhì)膠懸液包含 100 - 500 個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30 s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中 基質(zhì)膠 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

19. 將基質(zhì)膠和組織細胞小心均勻混合以防止氣泡產(chǎn)生并將懸液加入 24 孔板，30 μL每孔滴加在孔底中心，避免

懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

20. 將接種完成后的培養(yǎng)板置于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15 -25min 左右待基質(zhì)膠凝固后取出。

21. 每孔沿孔壁加入 500 μL 提前預熱的人胃上皮類器官原代培養(yǎng)基，再向 24 孔板最外周孔中每孔加入 500 μL 無菌水， 置于 37℃溫箱、5% CO2條件下培養(yǎng)。

注意：請沿孔壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

22. 每 3 d 更換一次培養(yǎng)基，從孔中小心地吸出培養(yǎng)基，并用新鮮的、預熱過的有機完全培養(yǎng)基替換，更換培養(yǎng)基時應避免破壞基質(zhì)膠。

23. 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下人類胃上皮類器官應在 5 - 8 天內(nèi)建成。

人胃上皮類器官的傳代培養(yǎng)

1.用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)過潤洗的 1.5 mL EP 管中。

2.用經(jīng)過潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，多次吹打使得類器官與基質(zhì)膠分離。

3. 300×g，室溫，離心 3 min，棄上清。用機械破壞或類器官消化液消化分離類器官。機械破壞時，將類器官懸液重懸在1 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中吹打混勻。使用消化液時，用經(jīng)過潤洗的槍頭加入 200 μL 類器官消化液并充分混勻，37℃條件下消化 1 - 3 min，消化結(jié)束后加入 1 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打混勻。密切監(jiān)視消化過程，盡可能縮短類器官在消化液中的時間。

 警告：不要在類器官解離液中解離5分鐘，因為這可能會導致較差的類器官的生長甚至破壞。根據(jù)經(jīng)驗，如果是小塊細胞的混合物，可以觀察到由10-50個細胞組成的細胞團，消化就完成了。

4. 300×g，室溫，離心 3 min，棄上清，再次加入 1 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基并混勻。

5. 300×g，室溫，再次離心 3min，棄上清后置于冰上。

6. 用適量的基質(zhì)膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30 s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7. 將基質(zhì)膠和類器官的混合懸液點入 24 孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔 30 μL 左右。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

8. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15 min 左右待基質(zhì)膠凝固后取出。

9. 配制人胃上皮類器官穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基。

10. 待基質(zhì)膠完全凝固后，沿孔壁加入提前預熱的人胃上皮類器官穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500 μL。

11. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到類器官需要進一步的實驗。