?；镄∈笮∧c類器官培養(yǎng)基套裝

產品描述

廈門?；?/span>小鼠小腸類器官培養(yǎng)基套裝是一款用于建立和維持小鼠腸道成體干細胞來源小腸類器官的完全培養(yǎng)基。生長在該完全培養(yǎng)基中的小鼠小腸類器官主要由干細胞、腸祖細胞和腸絨毛細胞、潘氏細胞、杯狀細胞和少量腸內分泌細胞組成，在自我更新能力、組織結構、細胞類型和功能方面，小鼠小腸類器官重現了體內小腸上皮的特征，因此是腸道穩(wěn)態(tài)和疾病機制研究的理想體外模型。

產品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質膠

潤洗液

類器官冷凍保存培養(yǎng)基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基的制備

使用無菌操作技術配制小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基。以下是準備 10mL 完全培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應調整

用量。

1. 冰上解凍 Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)和 Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x)。

注意： 解凍后，建議將 Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)和 Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x)

分別分裝后保存取用，避免反復凍融。

2. 將 200uL Mouse Intestinal Organoid Supplement B (50x)，40uL Mouse Intestinal Organoid Supplement C (250x) 加至

9.76mL Mouse Intestinal Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10mL 小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基。

注意：配制后的小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基可在 2-8°C 儲存，建議在兩周內使用。Mouse Intestinal Organoid Supplement

B(50x)內含有細菌及真菌抗生素(50x)。

小鼠小腸類器官原代培養(yǎng)

1. 依據所在單位批準的實驗動物倫理及操作規(guī)范犧牲小鼠。

2. 準備若干培養(yǎng)皿，加入 4℃預冷的 DPBS 備用。

3. 標準手術操作取小鼠小腸，根據實驗需求取總長度約 3 厘米至 20 厘米的小腸段，置于含 DPBS 的培養(yǎng)皿中。

4. 使用移液管或者注射器往小腸一端注入 DPBS 以沖洗腸內容物，沖洗后置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中，重復沖

洗數次至內容物完全被沖洗干凈，置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中。

5. 使用手術剪將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手使用手術鑷夾住腸組織一端，另一只手使用手術刀片輕輕刮去腸

腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗，重復清洗一次。

6. 將清洗后的小腸組織剪碎至 2mm 寬，并轉移至含有 5mmol/L EDTA 的預冷 DPBS 中消化，置于 4℃孵育30min。

7. 消化完成后，將組織碎片轉移到新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗，重復一次以去除 EDTA。

8. 用 5mL 移液管在含冷的 DPBS 的培養(yǎng)皿或 50mL 離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復穿過移液管尖以產

生機械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當可以看到大量的隱窩樣結構后，停止吹打，并

對吹打后的組織懸液進行 70μm 濾網過濾。

9. 收集穿過濾網的組織懸液，150g 離心力 4℃離心 3min。

10. 棄上清，使用 1mL DPBS 重懸組織沉淀，取 20uL 懸液進行鏡檢和隱窩計數，計數完成后吸取包含所需隱窩量

的懸液，150g 離心力 4℃離心 3min，棄上清后置于冰上。

11. 用適量的基質膠重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每 10uL基質膠懸液包含 200 至 600 個隱窩，重懸后置于

冰上，重懸時間不超過 30s 以避免基質膠過早凝固。

注意：基質膠稀釋比例應在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質膠的結構穩(wěn)定性。

12. 將基質膠和組織細胞的混合懸液點入 24 孔板底部正中央，每孔 30uL 左右，避免懸液接觸孔板側壁。

注意：為防止基質膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

13. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15min 左右待基質膠凝固。

14. 配制小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基。

15. 待基質膠完全凝固后，加入已配制好的小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500uL。

注意：請沿壁緩慢加入，避免破壞已凝固結構。

16. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

17. 每 3 天更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時應避免破壞 Matrigel。

18. 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下，小鼠小腸類器官應在 5 至 7 天內建成。

小鼠小腸類器官傳代培養(yǎng)

19. 用經過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉移至經

過潤洗液潤洗的 1.5mL EP 管中。

20. 用經過潤洗液潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，使得類器官與基質膠分離。

21. 150g 離心力 4℃離心 3min，棄上清，使用 DPBS 重懸底部類器官沉淀，150g 離心力 4℃再次離心3min，棄上

清后置于冰上。

22. 用適量的基質膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30s 以避免基質膠過早凝固。

注意：基質膠稀釋比例應在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質膠的結構穩(wěn)定性。

23. 將基質膠和類器官的混合懸液點入 24 孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側壁，每孔 30uL 左右。

注意：為防止基質膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

24. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15min 左右待基質膠凝固。

25. 配制小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基。

26. 待基質膠完全凝固后，加入已配制好的小鼠小腸類器官完全培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500uL。

27. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。