模基生物人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)基套裝

產(chǎn)品描述

廈門?；锶私Y(jié)直腸類器官培養(yǎng)基套裝是一種化學定義的細胞培養(yǎng)基，用于建立和培養(yǎng)成人干細胞衍生的人結(jié)腸類器官。 通過位于隱窩的干細胞及其祖細胞的增殖來驅(qū)動結(jié)腸上皮細胞的自我更新，使人類結(jié)腸類器官顯示出所有的特征。在結(jié)構、細胞類型組成和自我更新動力學方面，結(jié)腸上皮的影響很大。人類結(jié)腸發(fā)育和疾病的研究前景是前所未有的，人類結(jié)腸類器官也可能應用于再生生物學中的結(jié)腸上皮的體外擴張。

產(chǎn)品信息

其他自備材料和試劑

ABW &?；锘|(zhì)膠

上皮類器官基礎培養(yǎng)基  

類器官消化液  

潤洗液

類器官冷凍保存培養(yǎng)基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

胎牛血清(FBS)  

EDTA 

人結(jié)直腸類器官擴增培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基的制備

采用無菌技術制備人結(jié)腸類器官擴增培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基。在人結(jié)腸類器官擴增培養(yǎng)基中生長的類結(jié)腸器官絕大多數(shù)由LGR5干細胞，循環(huán)轉(zhuǎn)運擴增(TA)細胞，早期腸細胞和少量杯狀細胞組成。在人結(jié)腸類器官穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基中生長的類結(jié)腸器官含有LGR5干細胞、TA細胞、早期和成熟腸細胞、杯狀細胞、M細胞和腸內(nèi)分泌細胞，以及少量簇狀細胞。

以下是準備 10mL 完全培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應調(diào)整用量。

1.冰上解凍人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子B、人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子C、人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子D。

注意： 解凍后，建議將人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子B、人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子C、人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子D分別分裝后保存取用，避免反復凍融。

2. 配制人結(jié)腸類器官擴增培養(yǎng)基，專門用于原代培養(yǎng)和復蘇。添加200 μL人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子B (50x)、40 μL人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子C (250x)、40 μL人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子D (250x)、至9.72 mL人結(jié)腸類器官基礎培養(yǎng)基中，混合均勻。

3.配制人結(jié)腸類器官擴增培養(yǎng)基，專門用于培養(yǎng)傳代。添加200 μL人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子B (50x)、40 μL人結(jié)直腸類器官培養(yǎng)因子C (250x)至9.76 mL人結(jié)腸類器官基礎培養(yǎng)基中，混合均勻。

注意：配制后的人結(jié)腸類器官擴增培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基可在 2-8°C 儲存，建議在兩周內(nèi)使用。人結(jié)腸類器官培養(yǎng)因子B(50x)內(nèi)含有細菌及真菌抗生素(50x)。

人結(jié)腸類器官的原代建立

注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關的機構和政府法規(guī)。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

從初級組織中建立類器官

1. 使用離心管將原代人結(jié)腸組織收集在冰冷的原代組織儲存液中，將組織樣本保存在4°C，直到開始分離。

2. 評估獲得的組織碎片是否完全由上皮組織組成。如果存在脂肪或肌肉組織，請在解剖顯微鏡下使用手術剪刀或手術刀和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，請立即繼續(xù)下一步。

3.用上皮類器官基礎培養(yǎng)基或DPBS沖洗結(jié)腸組織，直到上清澄清。

4. 在腺窩結(jié)構分離之前，將基質(zhì)膠解凍并保持低溫。加入5 mL FBS至45 mL上皮類器官基礎培養(yǎng)基中制備10%FBS培養(yǎng)基。

5. 將組織在細胞培養(yǎng)皿中使用外科剪刀或手術刀切成5mm³的小碎片。

注：分離的樣品必須足夠小，能夠通過10ml移液管的尖端。

6.將分離的樣品放入一個15毫升的離心管中，管中含有10ml預冷的DPBS。

7.用10ml移液管清洗樣品至少10次。

注：在接下來的步驟中，使用10%FBS培養(yǎng)基潤洗10ml移液管的內(nèi)表面以避免樣品粘在移液管壁上。

8.讓管子靜止不動，直到樣品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清液，加入10mL預冷DPBS。

9. 重復步驟7和8 3-5次，直到上清完全清澈。

注：徹底清洗樣品是避免細菌污染的關鍵。

10. 向試管中加入10ml預冷DPBS，并加入2.5 mM EDTA 。把管子放在搖床上，在4°C的溫度下輕輕搖動40分鐘。

11. 用EDTA處理后，保持試管靜止，直到樣品沉淀到試管底部，然后用10ml移液管取上清液，加入10ml預冷DPBS。

12. 讓管子靜止不動，直到樣品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清。

13. 加入10ml預冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。隱窩結(jié)構會通過移液吸頭釋放到上清液中。將含有分離的隱窩的上清液放入新的15ml管中。

14. 加入10ml預冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。允許組織碎片在正常重力下下沉至少30秒鐘。隱窩被通過移液釋放到上清液中。將含有分離的隱窩的上清液放入一個新的15ml管中。

15. 在4℃、400g條件下離心3分鐘。吸出并丟棄上清。

16. 將沉淀重懸在1ml DPBS中，并將隱窩懸浮液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL管中。滴20 μL隱窩重懸液到培養(yǎng)皿中。在立體顯微鏡下計數(shù)隱窩的數(shù)量并計算隱窩的總數(shù)。

17. 在4℃、400g條件下離心3分鐘。吸出并丟棄上清。

18. 吸取上清，將沉淀重懸于基質(zhì)膠中。基質(zhì)膠應保存在冰上以防止固化。推薦重懸密度為每 25 μL基質(zhì)膠懸液包含 100 - 500 個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30 s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中 基質(zhì)膠 的結(jié)構穩(wěn)定性。

19. 將基質(zhì)膠和組織細胞小心均勻混合以防止氣泡產(chǎn)生并將懸液加入 24 孔板，30 μL每孔滴加在孔底中心，避免

懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應盡快完成。

20. 將接種完成后的培養(yǎng)板置于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15 -25min 左右待基質(zhì)膠凝固后取出。

21. 每孔沿孔壁加入 500 μL 提前預熱的人結(jié)腸類器官擴增培養(yǎng)基，再向 24 孔板最外周孔中每孔加入 500 μL 無菌水， 置于 37℃溫箱、5% CO2條件下培養(yǎng)。

注意：請沿孔壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構。