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產(chǎn)品描述

廈門?；?/span>小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)基套裝（擴增）是一種化學(xué)定義的細胞培養(yǎng)基，用于建立和培養(yǎng)從成體干細胞衍生的小鼠肝膽管類器官。肝膽管的自我更新上皮細胞是由位于肝臟的干細胞及其祖細胞的增殖所驅(qū)動的。肝膽管類器官因其上皮在結(jié)構(gòu)、細胞類型組成和自我更新動力學(xué)方面的表現(xiàn)，而具有真實器官的特征。肝膽管類器官可以在分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出肝樣細胞，為人類肝臟發(fā)育和疾病的研究提供了前所未有的模型。

產(chǎn)品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質(zhì)膠

組織消化液

上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基

類器官消化液

小鼠肝膽管(擴增)類器官培養(yǎng)基

類器官冷凍保存培養(yǎng)基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

FBS（胎牛血清）

EDTA

小鼠肝膽管類器官擴增培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基的制備

采用無菌技術(shù)制備小鼠肝膽管類器官擴增培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基。在小鼠肝膽管類器官擴增培養(yǎng)基中生長的小鼠肝膽管類器官絕大多數(shù)是肝膽管細胞。

以下是準(zhǔn)備 10mL 完全培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整用量。

1.冰上解凍小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)因子B、小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)因子C。

注意： 解凍后，建議將小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)因子B、小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)因子C分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融。

2. 配制小鼠肝膽管類器官擴增培養(yǎng)基，專門用于原代培養(yǎng)和復(fù)蘇。添加200 μL小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)因子B (50x)、40 μL小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)因子C (250x)至9.76 mL小鼠肝膽管類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混合均勻。

注意：配制后的小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)基可在 2-8°C 儲存，建議在兩周內(nèi)使用。小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)因子B(50x)內(nèi)含有細菌及真菌抗生素(50x)。

小鼠肝膽管(分化)類器官的培養(yǎng)

 小鼠肝膽管類器官原代培養(yǎng)

從初級組織中建立類器官

1. 使用離心管將原代小鼠肝膽管組織收集在冰冷的原代組織儲存液中，將組織樣本保存在4°C，直到開始分離。

2. 評估獲得的組織碎片是否完全由上皮組織組成。如果存在脂肪或肌肉組織，請在解剖顯微鏡下使用手術(shù)剪刀或手術(shù)刀和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，請立即繼續(xù)下一步。

3.用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或DPBS沖洗肝肝膽管組織，直到上清澄清。

4. 在腺窩結(jié)構(gòu)分離之前，將基質(zhì)膠解凍并保持低溫。加入5 mL FBS至45 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備10%FBS培養(yǎng)基。

5. 將組織在細胞培養(yǎng)皿中使用外科剪刀或手術(shù)刀切成5mm³的小碎片。

注：分離的樣品必須足夠小，能夠通過10ml移液管的尖端。

6.將分離的樣品放入一個15毫升的離心管中，管中含有10ml預(yù)冷的DPBS。

7.用10ml移液管清洗樣品至少10次。

注：在接下來的步驟中，使用10%FBS培養(yǎng)基潤洗10ml移液管的內(nèi)表面以避免樣品粘在移液管壁上。

8.讓管子靜止不動，直到樣品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清液，加入10mL預(yù)冷DPBS。

9. 重復(fù)步驟7和8 3-5次，直到上清完全清澈。

注：徹底清洗樣品是避免細菌污染的關(guān)鍵。

10. 向試管中加入10ml預(yù)冷DPBS，并加入2.5 mM EDTA 。把管子放在搖床上，在4°C的溫度下輕輕搖動40分鐘。

11. 用EDTA處理后，保持試管靜止，直到樣品沉淀到試管底部，然后用10ml移液管取上清液，加入10ml預(yù)冷DPBS。

12. 讓管子靜止不動，直到樣品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清。

13. 加入10ml預(yù)冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。隱窩結(jié)構(gòu)會通過移液吸頭釋放到上清液中。將含有分離的隱窩的上清液放入新的15ml管中。

14. 加入10ml預(yù)冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。允許組織碎片在正常重力下下沉至少30秒鐘。隱窩被通過移液釋放到上清液中。將含有分離的隱窩的上清液放入一個新的15ml管中。

15. 在4℃、400g條件下離心3分鐘。吸出并丟棄上清。

16. 將沉淀重懸在1ml DPBS中，并將隱窩懸浮液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL管中。滴20 μL隱窩重懸液到培養(yǎng)皿中。在立體顯微鏡下計數(shù)隱窩的數(shù)量并計算隱窩的總數(shù)。

17. 在4℃、400g條件下離心3分鐘。吸出并丟棄上清。

18. 吸取上清，將沉淀重懸于基質(zhì)膠中?；|(zhì)膠應(yīng)保存在冰上以防止固化。推薦重懸密度為每 25 μL基質(zhì)膠懸液包含 100 - 500 個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30 s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

19. 將基質(zhì)膠和組織細胞小心均勻混合以防止氣泡產(chǎn)生并將懸液加入 24 孔板，30 μL每孔滴加在孔底中心，避免

懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

20. 將接種完成后的培養(yǎng)板置于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15 -25min 左右待基質(zhì)膠凝固后取出。

21. 每孔沿孔壁加入 500 μL 提前預(yù)熱的小鼠肝肝膽管類器官擴增培養(yǎng)基，再向 24 孔板最外周孔中每孔加入 500 μL 無菌水， 置于 37℃溫箱、5% CO2條件下培養(yǎng)。

注意：請沿孔壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

22. 每 3 d 更換一次培養(yǎng)基，從孔中小心地吸出培養(yǎng)基，并用新鮮的、預(yù)熱過的有機完全培養(yǎng)基替換，更換培養(yǎng)基時應(yīng)避免破壞基質(zhì)膠。

23. 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，理想情況下小鼠肝膽管類器官應(yīng)在 5 - 8 天內(nèi)建成。

小鼠肝膽管類器官傳代培養(yǎng)

1. 用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng) 過潤洗液潤洗的 1.5mL EP 管中。

2. 用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，使得類器官與基質(zhì)膠分離。

3.200g 離心力室溫離心 3min。

4.棄上清，使用類器官消化液或用機械破壞。對于使用類器官消化液的細胞解離，在類器官消化液中重懸類器官懸浮液，移液器反復(fù)上下吹打并置于37°C孵育，直至類器官解離。使用帶濾芯移液頭每2分鐘反復(fù)上下吹吸8次，以幫助破壞類器官。密切監(jiān)視消化過程使在類器官解離液中的孵育時間最短。如發(fā)生機械故障，在1.5 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重懸類器官懸液。小心地用移液管吸取類器官懸浮液，反復(fù)上下30次，這將有助于消化。

警告:不要在類器官消化液中解離超過3分鐘，因為這可能會導(dǎo)致較差的類器官的生長甚至破壞。根據(jù)經(jīng)驗，如果是小塊細胞的混合物，可以觀察到由10-50個細胞組成的細胞團，消化就完成了。

5. 消化完成后，用1ml上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行一次沖洗，然后室溫下200g離心3分鐘。

6. 棄上清，用適量的基質(zhì)膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7. 將基質(zhì)膠和類器官的混合懸液點入 24 孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔 30uL 左右。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15min 左右待基質(zhì)膠凝固。

9. 配制小鼠肝膽管類器官穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基，并在37°C預(yù)熱。

10. 待基質(zhì)膠完全凝固后，加入已預(yù)熱的小鼠肝膽管類器官培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500uL。

11. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到類器官需要進一步的實驗。