?；镄∈蠼Y(jié)腸類器官培養(yǎng)基套裝

產(chǎn)品描述

廈門模基生物小鼠結(jié)腸類器官培養(yǎng)基套裝是一款用于擴(kuò)增和分化小鼠結(jié)腸類器官的完全培養(yǎng)基。擴(kuò)增時的小鼠結(jié)腸類器官主要由結(jié)腸干細(xì)胞和結(jié)腸祖細(xì)胞組成，分化后的小鼠結(jié)腸類器官由結(jié)腸吸收細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和少量腸內(nèi)分泌細(xì)胞組成。結(jié)腸類器官在自我更新和分化能力、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和功能方面，重現(xiàn)了體內(nèi)結(jié)腸上皮的特征，因此是小鼠結(jié)腸研究的理想體外模型。

產(chǎn)品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質(zhì)膠

上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基  

類器官消化液  

潤洗液

類器官冷凍保存培養(yǎng)基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂

 小鼠結(jié)腸類器官完全培養(yǎng)基的制備 

使用無菌操作技術(shù)配制小鼠結(jié)腸類器官的擴(kuò)增或分化培養(yǎng)基。以配制 10 mL 為例配置小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增或分化培養(yǎng)基，

如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整用量。

1. 冰上解凍 Mouse Colonic Organoid Supplement B (50x)，Mouse Colonic Organoid Supplement C (250x)和 Mouse

Colonic Organoid Supplement D (250x)。

2. 注意：各 Supplement 添加物解凍后，建議分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融。

3. 小鼠結(jié)腸類器官的擴(kuò)增培養(yǎng)基：將 200 uL Mouse Colonic Organoid Supplement B (50x)，40 μL Mouse Colonic

Organoid Supplement C (250x) 和 40 μL Mouse Colonic Organoid Supplement D (250x) 加 至 9.72 mL Mouse

Colonic Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10 mL 小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基。

4. 小鼠結(jié)腸類器官的分化培養(yǎng)基：將 200 μL Mouse Colonic Organoid Supplement B (50x)，40 μL Mouse Colonic

Organoid Supplement C (250x) 加至 9.76 mL Mouse Colonic Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10 mL

小鼠結(jié)腸類器官分化培養(yǎng)基。

5. 注意：配制后的小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增或分化培養(yǎng)基可在 2 - 8°C 儲存 10 天。此外，Mouse Colonic Organoid

Supplement B(50x)內(nèi)含有細(xì)菌及真菌抗生素(50x)。

小鼠結(jié)腸類器官原代培養(yǎng)

6. 依據(jù)所在單位批準(zhǔn)的實驗動物倫理及操作規(guī)范進(jìn)行動物組織取材，取材后的組織須在 2 - 8℃組織保存液或

DPBS 中迅速轉(zhuǎn)運至潔凈實驗室進(jìn)行組織處理和干細(xì)胞分離。

7. 準(zhǔn)備若干培養(yǎng)皿，加入 4℃預(yù)冷的 DPBS 備用。

8. 標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)操作分離小鼠結(jié)腸組織，根據(jù)實驗需求取總長度 3 - 10 cm 的結(jié)腸段，置于含 DPBS 的培養(yǎng)皿中。

9. 于生物安全柜中使用移液管將結(jié)腸一端注入 DPBS 以沖洗腸內(nèi)容物，沖洗后置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中，反

復(fù)沖洗數(shù)次至內(nèi)容物完全被沖洗干凈，置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中。

10. 使用手術(shù)剪將腸管剪開，腸腔面朝上，一只手持手術(shù)鑷夾住腸組織一端，另一只手持手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表

面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后，將腸組織置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)清洗一次。

11. 將清洗后的結(jié)腸組織剪碎至約 2 mm 長寬，并轉(zhuǎn)移至 5 - 10 mL 含有 2 mM EDTA 的預(yù)冷 DPBS 中消化，4℃孵

育 30 min。

12. 消化完成后，將組織碎片轉(zhuǎn)移到新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗，重復(fù)一次以去除 EDTA。

13. 用 5 mL 移液管在含冷的 DPBS 的培養(yǎng)皿或 50 mL 離心管中吹打、重懸組織碎片，使組織反復(fù)穿過移液管尖以

產(chǎn)生機(jī)械剪切力從而使隱窩與基底層分離，取一部分懸液鏡檢，當(dāng)可以看到大量的隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打并將吹打后的組織懸液通過 70 μm 濾器過濾。

14. 收集濾液，300×g，4℃離心 3 min。

15. 棄上清，使用 1 mL DPBS 重懸組織沉淀，取 20 μL 懸液進(jìn)行鏡檢和隱窩計數(shù)，計數(shù)完成后吸取包含所需隱窩量

的懸液，300×g，4℃離心 3 min，棄上清后置于冰上預(yù)冷。

16. 用適量的基質(zhì)膠重懸組織沉淀，推薦重懸密度為每 25 μL基質(zhì)膠懸液包含 50 - 300 個隱窩，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30 s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：Matrigel 稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

17. 將基質(zhì)膠和組織細(xì)胞小心均勻混合以防止氣泡產(chǎn)生并將懸液加入 24 孔板，25 μL 每孔滴加在孔底中心，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

18. 將接種完成后的培養(yǎng)板置于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15 min 左右待基質(zhì)膠凝固后取出。

19. 提前配制小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基。

20. 每孔沿孔壁加入 500 μL 提前預(yù)熱的小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，再向 24 孔板最外周孔中每孔加入 500 μL 無菌水，置于 37℃溫箱、5% CO2條件下培養(yǎng)。

注意：請沿孔壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

21. 每 3 d 更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時應(yīng)避免破壞基質(zhì)膠。

22. 密切監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，原代小鼠結(jié)腸類器官應(yīng)在 5 - 7 d 內(nèi)建成。

小鼠結(jié)腸類器官傳代培養(yǎng)和分化 

1. 用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)過潤洗液潤洗的 1.5 mL EP 管中。

2. 用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，多次吹打使得類器官與基質(zhì)膠分離。

3. 300×g，4℃離心 3 min，棄上清，用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭加入 200 μL類器官消化液并充分混勻，37℃條件下消化 1 - 3 min，消化結(jié)束后加入 1 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打混勻。

4. 300×g，4℃離心 3 min，棄上清，再次加入 1 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基并混勻。

5. 300×g，4℃再次離心 3min，棄上清后置于冰上。

6. 用適量的基質(zhì)膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時間不超過 30 s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：Matrigel 稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7. 將基質(zhì)膠和類器官的混合懸液點入 24 孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔 30 μL 左右。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15 min 左右待基質(zhì)膠凝固后取出。

9. 配制小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基。

10. 待基質(zhì)膠完全凝固后，沿孔壁加入提前預(yù)熱的小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500 μL。

11. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待新長出的類器官直徑超過 100 μm 后可進(jìn)行分化實驗。

12. 分化前需要吸去 24 孔板培養(yǎng)孔中的小鼠結(jié)腸類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，并加入 500 μL 提前配制的分化培養(yǎng)基，分化

通常需要 4 d 以上時間，分化期間每隔 2 d 更換一次分化培養(yǎng)基，分化完成后可進(jìn)行后續(xù)實驗。