模基生物人氣管類器官培養(yǎng)基套裝

產(chǎn)品描述

廈門?；锶藲夤茴惼鞴倥囵B(yǎng)基套裝是一種化學(xué)定義的細(xì)胞培養(yǎng)基，用于建立和維持來自人類氣管干細(xì)胞的人氣管類器官。氣管的自我更新上皮細(xì)胞是由基底細(xì)胞的增殖驅(qū)動(dòng)的。人氣管類器官包含基底細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、分泌細(xì)胞和少量神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，因此類器官顯示了氣管的所有特征。因此，上皮細(xì)胞在結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型組成和自我更新動(dòng)力學(xué)方面具有很大的應(yīng)用前景，可用于氣管穩(wěn)態(tài)與疾病的研究。

產(chǎn)品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質(zhì)膠

組織消化液

上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基

紅細(xì)胞裂解液

類器官消化液

潤洗液

類器官冷凍保存培養(yǎng)基(無血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

人氣管類器官完全培養(yǎng)基的制備

使用無菌操作技術(shù)配制人氣管類器官完全培養(yǎng)基。以下是準(zhǔn)備 10mL 完全培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整

用量。

1. 冰上解凍 Human Airway Organoid Supplement B (50x)和 Human Airway Organoid Supplement C (250x)。

注意： 解凍后，建議將 Human Airway Organoid Supplement B (50x)和 Human Airway Organoid Supplement C (250x)

分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融。

2. 將 200uL Human Airway Organoid Supplement B (50x)，40uL Human Airway Organoid Supplement C (250x) 加至

9.76mL Human Airway Organoid Basal Medium 中，充分混合，配制成 10mL 人氣管類器官完全培養(yǎng)基。

注意：配制后的人氣管類器官完全培養(yǎng)基可在 2-8°C 儲(chǔ)存，建議在兩周內(nèi)使用。Human Airway Organoid Supplement

B(50x)內(nèi)含有細(xì)菌及真菌抗生素(50x)。

人氣管類器官原代培養(yǎng)

注意:涉及初級(jí)人體組織材料的研究必須遵循所有相關(guān)機(jī)構(gòu)和政府的規(guī)定規(guī)定。在采集原始人體組織之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

從原始組織中建立類器官

1.收集經(jīng)活檢或手術(shù)獲得的原代人氣管組織塊，保存在冰冷的原代組織庫中溶液于離心管中。將組織樣本保存在4°C，直到開始分離。

2.評(píng)估獲得的組織片是否純由上皮組織組成，或是否也包含脂肪或肌肉組織。如果是這樣，盡可能在解剖顯微鏡下使用外科剪刀或手術(shù)刀和鑷子去除非上皮性成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，立即繼續(xù)下一步。

3.用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或DPBS沖洗氣管組織兩次。

4.將組織在細(xì)胞培養(yǎng)皿中使用外科剪刀或手術(shù)刀切成1-3毫米的小碎片。

5.用10mL組織消化液在15mL離心管中37°C消化組織碎片，孵育時(shí)間從30min到1h不等。仔細(xì)監(jiān)測(cè)消化過程，每5-10分鐘通過劇烈搖動(dòng)或反復(fù)吹吸移液來混合液體。當(dāng)大多數(shù)組織碎片能夠通過1mL移液管尖端時(shí)，消化過程即完成。

6. 將FBS加入組織消化液中，最終濃度為2%，用100 μm細(xì)胞篩過濾。

7. 收集過濾后的細(xì)胞，在4℃下250g離心3分鐘。如發(fā)現(xiàn)明顯的紅色顆粒，抽吸上清，用2mL紅細(xì)胞裂解液重懸，紅細(xì)胞在室溫下靜置1分鐘，然后在4℃下250g離心3分鐘。

8. 棄去上清液，將細(xì)胞懸液重懸于上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在4℃下250g離心3分鐘。再次重復(fù)此步驟。

9. 棄去上清液，將細(xì)胞懸液重懸于基質(zhì)膠中?；|(zhì)膠應(yīng)該保存在冰上以防止固化，此步驟應(yīng)盡快完成?；|(zhì)的用量取決于基質(zhì)的大小，推薦重懸密度為每 10uL基質(zhì)膠懸液包含大約10,000個(gè)細(xì)胞。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

10. 將基質(zhì)膠和組織細(xì)胞的混合懸液點(diǎn)入 24 孔板底部正中央，每孔 30uL 左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

11. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15min 左右待基質(zhì)膠凝固。

12. 準(zhǔn)備所需量的人氣管類器官完全培養(yǎng)基。

13.待基質(zhì)膠完全凝固后，加入已配制好的人氣管類器官完全培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500uL。

注意：請(qǐng)沿壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

14. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

15. 每 3 天更換一次培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)避免破壞基質(zhì)膠。

16. 密切監(jiān)測(cè)類器官生長狀態(tài)，理想情況下，人氣管類器官應(yīng)在 7 至 10 天內(nèi)建成。 

人氣管類器官傳代培養(yǎng)

1. 用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng) 過潤洗液潤洗的 1.5mL EP 管中。

2. 用經(jīng)過潤洗液潤洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，使得類器官與基質(zhì)膠分離。

3.250g 離心力室溫離心 3min。

4.棄上清，使用類器官消化液或用機(jī)械破壞。對(duì)于使用類器官消化液的細(xì)胞解離，在類器官消化液中重懸類器官懸浮液，移液器反復(fù)上下吹打并置于37°C孵育，直至類器官解離。使用帶濾芯移液頭每2分鐘反復(fù)上下吹吸8次，以幫助破壞類器官。密切監(jiān)視消化過程使在類器官解離液中的孵育時(shí)間最短。如發(fā)生機(jī)械故障，在1.5 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重懸類器官懸液。小心地用移液管吸取類器官懸浮液，反復(fù)上下30次，這將有助于消化。

警告:不要在類器官解離液中解離5分鐘，因?yàn)檫@可能會(huì)導(dǎo)致較差的類器官的生長甚至破壞。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，如果是小塊細(xì)胞的混合物，可以觀察到由10-50個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，消化就完成了。

5. 消化完成后，用1ml上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行一次沖洗，然后室溫下250g離心3分鐘。

6. 棄上清，用適量的基質(zhì)膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過 30s 以避免基質(zhì)膠過早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7. 將基質(zhì)膠和類器官的混合懸液點(diǎn)入 24 孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔 30uL 左右。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15min 左右待基質(zhì)膠凝固。

9. 配制人氣管類器官完全培養(yǎng)基。

10. 待基質(zhì)膠完全凝固后，加入已配制好的人氣管類器官完全培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500uL。

11. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到類器官需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。