【每周質(zhì)檢】小鼠氣道上皮類器官培養(yǎng)
2022年6月17日，香港大學(xué)周婕/袁國(guó)勇團(tuán)隊(duì)聯(lián)合類器官先驅(qū) Hans Clevers 及復(fù)旦大學(xué)姜世勃 ，在 Cell Discovery 期刊在線發(fā)表了題為：A bipotential organoid model of respiratory epithelium recapitulates high infectivity of SARS-CoV-2 Omicron variant 的研究論文。論文表示該團(tuán)隊(duì)建立了一個(gè)雙潛能類器官培養(yǎng)系統(tǒng)，能夠在體外可重復(fù)地?cái)U(kuò)展整個(gè)人類呼吸道上皮細(xì)胞，用于模擬呼吸道疾病，也包括新冠肺炎，為呼吸道疾病治療研究開啟了新的大門。
當(dāng)然在崇拜大佬的同時(shí)，我們也需要腳踏實(shí)地一步一步做實(shí)驗(yàn)，而選擇一款優(yōu)質(zhì)的基質(zhì)膠，無疑是類器官方面研究成功的第一步。
這周就讓我們一起來看看模基基質(zhì)膠培養(yǎng)氣道上皮類器官的效果吧。
一.
樣本信息
?；|(zhì)膠
| 名稱 | 貨號(hào) | 批號(hào) | 濃度(mg/mL) |
| 類器官專用基質(zhì)膠 | 082755/0827555 | 20224105CWD | 10.76 |
| 低因子無酚紅金牌基質(zhì)膠 | 082703/0827035 | 20224123CWD | 8.86 |
對(duì)照組
| 廠家 | 產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 批號(hào) |
| Brand C | 低因子無酚紅基質(zhì)膠 | 356231 | 2010005 |
二.
實(shí)驗(yàn)流程
1.培養(yǎng)材料
試劑：MatrigengeL Matrix、小鼠氣道上皮類器官培養(yǎng)試劑盒、組織解離試劑盒、潤(rùn)洗液、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DPBS、雙抗。
耗材：48孔細(xì)胞培養(yǎng)板、離心管（規(guī)格為1.5mL、15mL和50mL）、細(xì)胞培養(yǎng)皿（6cm）、移液器（規(guī)格為10μL、200μL、1000μL）、無菌吸頭（規(guī)格為 10μL、200μL 和1000μL）、無菌鑷子、無菌組織剪 、100μm細(xì)胞過濾器。
2.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
（1）MatrigengeL Matrix 4℃化凍；
（2）小鼠氣道上皮類器官完全培養(yǎng)基的制備：將200μL Mouse Airway Organoid Supplement B (50x)，40μL Mouse Airway Organoid Supplement C (250x) 加至 9.76mL Mouse Airway Organoid Basal Medium中，充分混合，配制成10mL小鼠氣道上皮類器官完全培養(yǎng)基。室溫平衡，可在2℃-8°C儲(chǔ)存，建議在兩周內(nèi)使用；
（3）準(zhǔn)備足量添加1%雙抗的DPBS；
（4）配制10mL組織解離液，現(xiàn)配現(xiàn)用，37℃搖床混勻預(yù)熱，未用完消化液可放置-20℃保存1周（10mL基礎(chǔ)液加入500μL消化酶）。
3.類器官培養(yǎng)
（1）組織樣本收集：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌，在無菌條件下將氣管取出，放入4℃預(yù)冷的DPBS溶液中。
（2）組織清洗：用冰冷的DPBS清洗2~3次，將組織轉(zhuǎn)移到新的1.5mL EP管中，用無菌組織剪將組織剪成約0.5mm3的碎片。
（3）消化液消化：將剪碎的組織用適量的原代組織液消化液重懸于37℃，100rpm條件下的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，消化30-60分鐘，每隔10分鐘觀察組織消化情況，待組織塊明顯分散，懸液較渾濁時(shí)，取適量組織消化懸液鏡檢，待懸液中有較多細(xì)胞團(tuán)即可終止消化。若組織碎塊較大或消化不完全可適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間，消化期間可以使用不同規(guī)格1mL的移液器吹打組織消化懸液，幫助充分消化。
（4） 終止消化：當(dāng)鏡檢懸液出現(xiàn)大量氣管上皮細(xì)胞時(shí)，即表明消化完成，在消化完成的組織懸液中加入胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）至終濃度達(dá) 1%~5%以減緩消化作用，同時(shí)輕輕吹打5~10次。
（11）持續(xù)培養(yǎng)：將細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每1天于倒置顯微鏡下觀察類器官的生長(zhǎng)狀態(tài)，每2~3天更換完全培養(yǎng)基，于倒置顯微鏡下拍照，記錄類器官的形態(tài)和分布。
三.
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
四.
實(shí)驗(yàn)分析
1.為減少實(shí)驗(yàn)誤差，對(duì)膽管類器官傳代后培養(yǎng)效果進(jìn)行測(cè)評(píng)。
2.Brand C該批次基質(zhì)膠培養(yǎng)后兩次均有明顯的細(xì)胞貼壁現(xiàn)象，而?；|(zhì)膠所培養(yǎng)的氣道上皮類器官細(xì)胞飽滿、邊緣清晰、幾乎沒有貼壁現(xiàn)象，該現(xiàn)象表明模基基質(zhì)膠在支撐性能上，優(yōu)于Brand C基質(zhì)膠。
?；锘|(zhì)膠經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)檢驗(yàn)證，具備安全性高、濃度多樣性、批次穩(wěn)定性好、低內(nèi)毒素、無污染。在購(gòu)買?；a(chǎn)品時(shí)，根據(jù)用戶個(gè)性化的需求對(duì)用戶進(jìn)行最佳產(chǎn)品、貨號(hào)的推薦，以便用戶獲得性價(jià)比最高、效果最優(yōu)的產(chǎn)品。
進(jìn)行類器官培養(yǎng)時(shí)，推薦使用低生長(zhǎng)因子基質(zhì)膠與類器官專用基質(zhì)膠，低生長(zhǎng)因子基質(zhì)膠是進(jìn)行了低因子處理的。在天然基底膜基質(zhì)中含有微量生長(zhǎng)因子，其中有EGF、IGF、VEGF這類促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)分化的因子，也有TGF-β這類可能促進(jìn)細(xì)胞凋亡的因子。低生長(zhǎng)因子型基質(zhì)膠減少干擾因子，能更好的進(jìn)行人工誘導(dǎo)分化，而類器官專用基質(zhì)膠則是經(jīng)過多項(xiàng)附加測(cè)試驗(yàn)證，確定效果脫穎而出的低生長(zhǎng)因子基質(zhì)膠，培養(yǎng)效果穩(wěn)定而又出眾。
六.
參考資料
1、類器官新突破：香港大學(xué)周婕/袁國(guó)勇團(tuán)隊(duì)創(chuàng)立首個(gè)雙潛能呼吸道類器官培養(yǎng)系統(tǒng)（健康界發(fā)文）
