成管實驗三鋪細(xì)胞量多少最合適

一、實驗材料

細(xì)胞：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

培養(yǎng)基：ECM專用培養(yǎng)基、含10%ABW胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基

耗材：預(yù)冷槍頭、預(yù)冷 96 孔板和預(yù)冷1.5毫升離心管

其他：胰酶，PBS，Matrigengel（ABW貨號：0827045/0827065，金牌基質(zhì)膠）

二、實驗步驟

A.實驗準(zhǔn)備

1.實驗過程中所需耗材包括但不限于：10微升、200微升、1毫升移液槍槍頭；凍存管或1.5毫升離心管；小鑷子。耗材需要高壓滅菌并烘干后置于-20℃-4℃環(huán)境中預(yù)冷。

2.提前打開制冰機，用冰盒裝滿冰。

3.提前24小時將基質(zhì)膠放置在冰盒里，并將冰盒置于4℃冰箱，在此期間盡量減少開關(guān)冰箱門。

B.準(zhǔn)備基質(zhì)膠

1.實驗前將基質(zhì)膠、槍頭、1.5毫升離心管和96孔板置于冰盒中預(yù)冷。

C.鋪基質(zhì)膠

1.取1.5毫升離心管，按以下比例配基質(zhì)膠。

240微升原膠+120微升 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基

2.混勻基質(zhì)膠后，在96孔板中按照每孔50微升的量加入，避免產(chǎn)生氣泡。（注：可以將槍頭剪短前端，移液器打到一檔比較不容易出現(xiàn)氣泡。若是有氣泡，可以對準(zhǔn)氣泡，用槍將氣泡吸上來或者戳破氣泡。配膠時可以按比例多配一點，不要剛好每孔配50微升。）

3.在37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中放置1小時。

D.鋪細(xì)胞

1.棄上清：當(dāng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)皿中生長至70~80%時，吸去培養(yǎng)液上清。

2.清洗：用1毫升PBS清洗懸浮死細(xì)胞。

3.消化：用胰酶消化下來，用含10%ABW胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化（10厘米皿用1毫升胰酶，1毫升含10%ABW胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，6厘米皿用500微升胰酶，500微升含10%ABW胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。）

4.離心：轉(zhuǎn)移至1.5毫升離心管，1200轉(zhuǎn)數(shù)，5分鐘離心。

5.用1毫升ECM專用培養(yǎng)基重懸。

6.計數(shù)：吸取10微升于計數(shù)板，用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為10000個細(xì)胞/孔、30000個細(xì)胞/孔、50000個細(xì)胞/孔

7.按照每孔加入50微升重懸液加入凝膠好的96孔板中。

8.在5％二氧化碳37℃培養(yǎng)箱孵育4小時、24小時。

E.觀察結(jié)果，拍照。