Transwell實驗——基本操作

一、基本原理：

Transwell小室在培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，小室放入的培養(yǎng)板稱下室，上室底部為一層聚碳酸酯膜，這層膜具有通透性，將上室培養(yǎng)液和含下室培養(yǎng)液隔開，下室中的培養(yǎng)液可以影響上室中的細(xì)胞，從而研究下室中液體對細(xì)胞的生長、遷移的影響，細(xì)胞接種到低營養(yǎng)的培養(yǎng)液里，通常膜孔都被ABW^@Matrigengel覆蓋，模仿細(xì)胞外基質(zhì)，腫瘤細(xì)胞必須分泌水解酶并通過變形運動才能穿過鋪有ABW^@Matrigengel的濾膜，計數(shù)進(jìn)入下室的細(xì)胞量可反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。

 

二、實驗儀器和材料  

細(xì)胞：SGC-7901

培養(yǎng)基：1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含10%ABW胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基（ABW血清貨號：AB20214403）

耗材：預(yù)冷槍頭、預(yù)冷1.5毫升離心管和放有8微升Transwell小室的預(yù)冷24孔板

其他：胰酶，PBS，0.1%結(jié)晶紫染液，4％多聚甲醛，Matrigengel（ABW貨號：0827045）

 

三、實驗步驟

 

A.配培養(yǎng)基：5毫升ABW胎牛血清+500微升雙抗+44.5毫升1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基混勻于50毫升離心管。

 

B.準(zhǔn)備基質(zhì)膠

1.在冰上4℃過夜融化Matrigengel，實驗前轉(zhuǎn)移到冰盒中。（注意：準(zhǔn)備-20℃預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigengel）

2.將槍頭、1.5毫升離心管、放有Transwell小室的24孔板和1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基放入冰盒中預(yù)冷。

 

C.基質(zhì)膠鋪板（冰上操作）

1.稀釋Matrigengel：先將8微升 Matrigenge加入預(yù)冷的1.5毫升離心管中，然后加入64微升預(yù)冷的1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并用槍頭吹打充分混勻。（Matrigenge和基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1:8的比例稀釋）

2.吸取60微升稀釋后的Matrigengel，垂直加入Transwewll上室中，均勻平鋪在底部。另吸取60微升1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基于小室中，作為空白對照。放入培養(yǎng)箱（37℃，5%CO₂)中孵育3h，使Matrigengel聚合成薄膜。（注意：鋪膠過程不要產(chǎn)生氣泡，均勻鋪膠。）

3.孵育后將上室中多余液體吸掉，在每孔中加入100微升1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，于培養(yǎng)箱放置30 分鐘，進(jìn)行基底膜水化。

4. 將上室中多余液體吸掉，準(zhǔn)備接種細(xì)胞。

 

D.制作細(xì)胞懸液

1.制作細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓12-24h，進(jìn)一步去除血清的影響。（此步驟可選擇操作，如果細(xì)胞遷移能力不強，可考慮進(jìn)行此步驟增加血清對細(xì)胞的誘導(dǎo)。）

2.取匯合度達(dá)70%-80%的細(xì)胞進(jìn)行消化并離心棄廢液，然后用1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度至每孔5萬個。（可根據(jù)不同細(xì)胞系Transwell遷移實驗的細(xì)胞密度進(jìn)行調(diào)整。）

 

E.接種細(xì)胞

1.在24孔板下室加入500微升含10%ABW胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基。然后用鑷子將Transwell小室置于24孔板內(nèi)（注意：下層培養(yǎng)液和小室間經(jīng)常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。）

2.每孔加入200微升細(xì)胞懸液到Transwell上室中。

3.培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后可進(jìn)行固定染色。（時間點可根據(jù)腫瘤細(xì)胞侵襲能力而定，一般24-48h，還需要考慮細(xì)胞狀態(tài)和消化時間對細(xì)胞的影響。另外建議最好接種細(xì)胞后1-2h把培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱里拿出來看看，確保沒有大氣泡產(chǎn)生。）

 

F.細(xì)胞固定

1.取出Transwell小室，吸走培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦拭Matrigengel和上室內(nèi)的細(xì)胞。

2.在24孔板干凈的孔中加入4％多聚甲醛600微升，將小室放入后固定20-30分鐘。

 

G.細(xì)胞染色及計數(shù)

1.棄去固定液，將小室在盛有PBS的6厘米皿中涮洗1遍。（注意避免觸碰到小室底部）

2.用0.1%結(jié)晶紫染色5-10分鐘，PBS涮洗3遍，除去未與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)晶紫，用棉簽輕輕擦拭小室的上側(cè)，將非特異性結(jié)合于小室上表面的染料擦掉，以便后續(xù)鏡檢。

3.適當(dāng)風(fēng)干后，在10倍顯微鏡下選取5個視野觀察細(xì)胞并計數(shù)。