FAQ

1.基質(zhì)膠是否需要稀釋，稀釋比例是多少？不同孔板添加的體積是多少？

由于每一批ABW^®Matrigengel基底膜基質(zhì)濃度會有差異，針對標(biāo)準(zhǔn)濃度的基質(zhì)膠，建議根據(jù)以下表格進(jìn)行稀釋。

稀釋比例	96孔板	24孔板
無稀釋	50μL原膠/孔	200μL原膠/孔
1:1	25μL原膠+ 25μLDMEM/孔	100μL原膠+ 100μLDMEM/孔
2:1	33.3μL原膠+ 16.7μLDMEM/孔	133.3μL原膠+ 66.7μLDMEM/孔

 

技巧一：判斷是否加入合適體積的基質(zhì)膠？

 

將孔板下面放置一張格子紙（如圖），垂直透過每個孔觀察下面的格子紙：

（1）如果觀察到的格子比實際尺寸小，判斷基質(zhì)膠加入體積不足；

（2）如果觀察到的格子比實際尺寸大，判斷基質(zhì)膠加入體積過多；

（3）如果觀察到的格子與實際尺寸一致，判斷基質(zhì)膠加入體積合適。

 

2. 為什么我鋪的基質(zhì)膠液面總是不平？或者有氣泡？

a) 收貨時確?；|(zhì)膠是固態(tài)，并在干冰中儲存，收貨后基質(zhì)膠儲存在-20℃。儲存方式不當(dāng)可能導(dǎo)致基質(zhì)膠的質(zhì)量受損，容易使膠面不平及產(chǎn)生氣泡。

b) 基質(zhì)膠應(yīng)置于碎冰上并4℃過夜融化，確保所有操作在冰上進(jìn)行。高溫可能加速膠凝固，導(dǎo)致膠面不平及產(chǎn)生氣泡。

c) 向孔板中加基質(zhì)膠前使用渦旋振蕩的方式保證膠液處于均勻的狀態(tài)，如果膠濃度高可考慮做適當(dāng)稀釋。

d) 向孔板中加基質(zhì)膠時盡可能垂直加入，避免氣泡產(chǎn)生。

技巧二：剛加膠時出現(xiàn)明顯的氣泡，可使用吸頭輕觸戳破。

 

3.為什么我的成管實驗中細(xì)胞不能形成連續(xù)的網(wǎng)格？

a) 建議使用3-5代狀態(tài)較好且融合度70%-80%的HUVEC細(xì)胞進(jìn)行成管試驗，此時細(xì)胞成管能力比較強(qiáng)。

b) 在使用胰酶消化細(xì)胞時，在顯微鏡下邊觀察邊消化，當(dāng)細(xì)胞變圓時及時終止消化過程。消化過度會影響成管。

c) 盡可能保證細(xì)胞數(shù)量為約3萬個/孔，細(xì)胞數(shù)量過少會使細(xì)胞無法形成連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)。

d) 選擇低生長因子基質(zhì)膠進(jìn)行成管實驗時，可考慮在培養(yǎng)基中添加生長因子刺激細(xì)胞成管。

技巧三：由于計數(shù)方式的差異可能導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量的差異，可進(jìn)行預(yù)實驗測試合適的細(xì)胞數(shù)鋪板，細(xì)胞靜置后鏡下觀察如下圖數(shù)量比較適宜。

 

4.成管實驗到底需要幾個小時？6個小時？20個小時？小管形成后有塌縮了？

a) 成管時間與細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)。細(xì)胞狀態(tài)好時，2-3小時開始成管，細(xì)胞狀態(tài)較差時，可能18-24h成管。建議第一次實驗時，每4個小時觀察一次。

b) 成管時間取決于培養(yǎng)基中血管生成因子的濃度，腫瘤條件培養(yǎng)基中血管生成因子較豐富，容易成管，而基礎(chǔ)培養(yǎng)基成管時間較久。

c) 如果使用原代內(nèi)皮細(xì)胞而非永生化細(xì)胞，開始成管的時間會延遲幾個小時。

d) 小管形成后有塌縮:可能是培養(yǎng)時間過久，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡導(dǎo)致。

 

5.其他注意事項：

a) HUVEC細(xì)胞容易沉底，易使孔間細(xì)胞數(shù)量不一致，細(xì)胞數(shù)量不一致會影響成管結(jié)果，數(shù)量多的孔容易成管。每孔加樣前需用移液器吹打混勻。

b) 基質(zhì)膠濃度高時，移液器吸入的體積可能不準(zhǔn)，可用無菌剪剪去槍頭前端后再去吸入基質(zhì)膠。

c) 實驗前一天無血清饑餓細(xì)胞，第二天成管效果會更好。

 

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